лит обзор


МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ

 

Государственное образовательное учреждение
высшего п
рофессионального образования
«Т
амбовский государственный университет

Имени Г.Р. Державина»

 

Институт математики, физики и информатики

 

ОТЧЕТ

о прохождении производственной практики

 

Исследование динамики роста микроорганизмов

 

 

место прохождения практики: Кафедра теоретической и экспериментальной физики ИМФИ ТГУ им. Г.Р. Державина

 

период прохождения практики: с « » декабря 2012 г. по « » декабря 2012 г.

 

 

 

Студент: 52 группы Чуфистова Елена Алексеевна

Руководитель: к. ф.-м. н., доцент Желтов М.А.

 

 

 

Тамбов 2012

Содержание

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Введение

Одно из первичных и основных свойств мельчайших живых клеток - рост и размножение микроорганизмов. В силу этого кинетика и стехиометрия роста микроорганизмов составляет основу количественного анализа микробиологических процессов. Микробиологические процессы составляют суть, с одной стороны, многих промышленных технологий синтеза биомассы, биологически активных веществ, а с другой, стадии деструкции в природном круговороте веществ.

При наблюдении за процессами роста микроорганизмов и трансформации вещества в природных системах соблюсти условия воспроизведения параметров внешней среды трудно. Ограниченность наших знаний позволяет с большим основанием сказать, что теория роста популяций микроорганизмов, построенная на базе данных управляемого биосинтеза микроорганизмов и для решения прикладных задач, оказывается недостаточно глубоко проработанной, чтобы с таким же успехом решать экологические задачи [93]. При строгом рассмотрении экспериментальных данных не только природные, но и процессы в управляемых или контролируемых условиях существенно отличаются от прогноза, который дает его математическая модель (количественное описание). В связи с этим следует обратить внимание на сложный характер процесса размножения микроорганизмов [18, 91].

Один из реальных путей построения адекватного представления об этом явлении заключается в изучении областей существования микробных популяций с особыми типами роста популяций микроорганизмов. Модель роста популяции (математическая и физическая) должна быть поддержана детальным рассмотрением значимых, в смысле регуляторных свойств, физиолого-биохимических характеристик биологического объекта и отнесением его к определенному типу процессов роста микроорганизмов.

Целью данной работы является описание особенностей кинетики роста микроорганизмов, как динамических систем и на основе качественной теории роста микробных популяций, и экспериментальное обоснование теоретических выводов разработками биотехнологий. Для выделения областей особого поведения популяций микроорганизмов в работе проводится классификация характеристик их роста. Затем популяция с определенным типом роста рассматривается как динамическая система взаимодействующих организмов и среды (субстрата, продуктов его превращения или метаболитов и других переменных). Детализация на биохимическом и генетическом уровнях описания резко увеличивает сложность (размерность) анализируемой системы, что позволяет делать почти любые выводы. Поэтому для объяснения расхождения наблюдаемых и прогнозируемых результатов усложнение моделей проводится последовательно, рассматриваются различные биофизические механизмы регуляции плотности популяции микроорганизмов, независимо от формы записи функции размножения. Типизация и усложнение моделей роста микроорганизмов (в рамках универсальной модели Моно) и сопоставление их с найденными в соответствующей области примерами нетипичного поведения составляют методологическую основу исследования особенностей кинетики роста микробных популяций в настоящей работе.

 

 

 

 

 

 

 

1. Клеточный рост

1.1. Клеточный цикл

Изучение кинетических особенностей развития клеточных популяций невозможно без понимания закономерностей раз­вития одной клетки. Эти закономерности описываются кле­точным циклом, который состоит по крайней мере из четы­рех фаз (рис. 1.1):

1. Митоз (М-фаза). В этой фазе происходит деление материнс­кой клетки на две дочерние.

2. -фаза-период времени между концом М-фазы и нача­лом синтеза ДНК.

3. S-фаза -период синтеза ДНК.

4. -фаза-период между концом S-фазы и началом M-фазы.

Совокупность G1, S-и G2-фаз принято называть интерфазой.

 

Длительность клеточно­го цикла подвержена значи­тельным вариациям и может составлять от 1-2 ч (для эм­бриональных, микробных клеток) до нескольких де­сятков лет (гепатоциты, нейроны).

 

Рис. 1.1. Клеточный цикл

 

В основном различия в длительности клеточных циклов связаны с различи­ями в длительности G1-фазы.

У однотипных клеток могут происходить случайные из­менения длительности G1-фазы, приводящие к десинхронизации процессов кле­точного деления, даже если изначально процессы клеточного деления были синхронизиро­ваны.

 

1.2. Типичная кривая роста клеточной культуры

При занесении бактерий в питательную среду они обычно растут до тех пор, пока содержание какого-нибудь из необходимых им компонентов среды не достигнет минимума, после чего рост прекращается. Если на протяжении этого времени не добавлять питательных веществ и не удалять конечных продуктов обмена, то получим так называемую периодическую культуру (популяцию клеток в ограниченном жизненном пространстве). Рост в такой «закрытой системе» подчиняется закономерностям, действительным не только для одноклеточных, но и для многоклеточных организмов. Периодическая культура ведет себя как многоклеточный организм с генетически ограниченным ростом.

Кривая, описывающая зависимость логарифма числа живых клеток от времени, называется кривой роста. Типичная кривая роста (рис. 1.2) имеет S-образную форму и позволяет различить несколько фаз роста, сменяющих друг друга в определенной последовательности и в большей или меньшей степени выраженных: начальную (или лаг-) фазу, экспоненциальную (или логарифмическую) фазу, стационарную фазу и фазу отмирания.

Рис.1.2. Кривая роста бактериальной культуры

1.Начальная фаза. Эта фаза охватывает промежуток времени между инокуляцией и достижением максимальной скорости деления. Продолжительность этой фазы зависит главным образом от предшествовавших условий культивирования и возраста инокулята, а также от того, насколько пригодна для роста данная среда. Если инокулят взят из старой культуры (в стационарной фазе роста), то клеткам приходится сначала адаптироваться к новым условиям путем синтеза РНК, образования рибосом и синтеза ферментов. Если источники энергии и углерода в новой среде отличаются от тех, какие были в предшествующей культуре, то приспособление (адаптация) к новым условиям может быть связано с синтезом новых ферментов, которые ранее не были нужны и поэтому не синтезировались. Образование новых ферментов индуцируется новым субстратом.

2.Экспоненциальная фаза. Экспоненциальная (логарифмическая) фаза роста характеризуется постоянной максимальной скоростью деления клеток. Эта скорость во время экспоненциальной фазы зависит от вида бактерий, а также от среды. Энтеробактерии делятся через каждые 15-30 мин. У других бактерий время генерации значительно больше: у многих почвенных видов оно достигает 60-150 мин, а у некоторых даже 5-10 ч.

Величина клеток и содержание в них белка у многих бактерий тоже остаются в экспоненциальной фазе постоянными. В известном смысле можно сказать, что бактериальная культура в этом случае состоит из «стандартных клеток». Если точно установлено, что число клеток, содержание в них белка и их сухая биомасса увеличиваются с одинаковой скоростью, то за ростом культуры можно следить, пользуясь каким-нибудь одним из этих показателей. Нередко, однако, и в экспоненциальной фазе роста клетки периодической культуры претерпевают изменения, так как постепенно изменяется среда: уменьшается концентрация субстрата, увеличивается плотность клеточной суспензии и накапливаются продукты обмена. В связи с тем, что в экспоненциальной фазе скорость деления клеток относительно постоянна, эта фаза наиболее удобна для определения скорости деления (и скорости роста). Изучая влияние факторов среды (рН, окислительно-восстановительного потенциала, температуры, аэрации и т. д.), а также пригодность различных субстратов, следят за увеличением числа клеток или за мутностью (экстинкцией) клеточной суспензии во время экспоненциального роста.

3.Стационарная фаза. Стационарная фаза наступает тогда, когда число клеток перестает увеличиваться. Скорость роста зависит от концентрации субстрата при уменьшении этой концентрации, еще до полного использования субстрата, она начинает снижаться. Поэтому переход от экспоненциальной фазы к стационарной происходит постепенно. Скорость роста может снижаться не только из-за нехватки субстрата, но также из-за большой плотности бактериальной популяции, из-за низкого парциального давления или накопления токсичных продуктов обмена; все эти факторы вызывают переход к стационарной фазе. И в стационарной фазе могут еще происходить такие процессы, как использование запасных веществ, распад части рибосом и синтез ферментов. Наблюдаемая картина зависит от того, какой именно фактор лимитирует рост. Быстро гибнут лишь очень чувствительные клетки; другие еще долго сохраняют жизнеспособность - до тех пор, пока есть возможность получать необходимую для этого энергию в процессе окисления каких-либо запасных веществ или клеточных белков.

4.Фаза отмирания. Фаза отмирания и причины гибели бактериальных клеток в нормальных питательных средах изучены недостаточно. Сравнительно легко понять случаи, когда в среде накапливаются кислоты. Число живых клеток может снижаться экспоненциально. Иногда клетки лизируются под действием собственных ферментов (автолиз).

Последовательные переходы от фазы 1 к фазе 4 наблюдаются в значительной степени за счет истощения субстратов, необхо­димых для роста популяции клеток, или же за счет накопления токсичных продуктов их жизнедеятельности.

Впервые на лимитирование процессов роста культур клеток субстратами ферментативных реакций обратил внимание Ж. Моно. Субстраты, ограничивающие рост микробных популяций, по­лучили название лимитирующих.

Было показано, что зависимость скорость роста клеточной культуры от концентрации лимитирующего субстрата можно представить в следующем виде:

 

где Nчисло микробных клеток; µm — коэффициент пропорци­ональности, получивший название предельная максимальная удель­ная скорость роста, Ks параметр, характеризующий сродство субстрата к клеткам культуры.

 

Достаточно часто вводят следующее обозначение:

Тогда µ-является коэффициентом пропорциональности, ха­рактеризующим клеточный рост. Его принято называть удельной скоростью роста. Размерность удельной скорости роста - обрат­ное время: мин-1, ч-1 и т.д.

На основании литературных данных было показано, что величины варьируют в пределах 10-2 — 10-5 с1, а значения Ks в диапазоне 10-2 — 10-8 М (рис. 1.3). Как следует из рисунка, величины Кг практически полностью соответствуют наблюдае­мым значениям констант Михаэлиса.

Среднее значение µт составляет порядка 10-4 с-1. Исходя из стандартного соотношения между константой скорости первого по­рядка и временем удвоения численности клеточной популяции, видно, что среднее время увеличения клеточной популяции вдвое составляет около 2 ч.

Рис.1.3. Плотность распределения кинетических параметров ферментных реакций kкат, Кт и кинетических параметров клеточного роста µm, КS

Размерность kкат µm,с-1Кm, KsМ.

 

 

На практике отсутствуют клетки с µm выше 10-2 и ниже 10-6 с. Верхний предел скорости роста клеточных популяций связан со скоростью процессов репликации (удвоения) ДНК клеточного цикла. Нижний предел скорости роста, по-видимо­му, связан с малой жизнеспособностью медленно растущих по­пуляций.

 

1.3 Экспоненциальная фаза роста клеточных культур

 

В условиях, когда концентрация субстратов и других компо­нентов, необходимых для роста клеток постоянна, процесс увеличе­ния числа клеток носит автокаталитический характер. Данный про­цесс описывается следующим дифференциальным уравнением:

 

(1)

 

где N — число клеток, µ — удельная скорость роста.

Дифференциальное уравнение (1) является уравнением с разделяющимися переменными. Оно легко может быть решено:

(2)

где N0 — начальное число клеток.

Уравнение (2) описывает экспоненциальную фазу роста клеточных культур. В полулогарифмических координатах данное уравнение может быть представлено следующим об­разом:

(3)

Рис.1.4. Определение кинетических параметров роста клеточной культуры.

 

Таким образом, анализ эк­спериментальных данных по исследованию кинетики рос­та клеточных популяций сле­дует начинать в полулогариф­мических координатах. Если в этих координатах наблюдает­ся спрямление эксперимен­тальных данных, то они опи­сываются уравнением (1.4.).

Тангенс угла наклона прямой равен удельной скорости роста клеточной культуры, а ордината точки пересечения графика с осью Y равна начальному числу клеток в культуре (рис. 1.4.).

Достаточно часто удельная скорость роста клеточной куль­туры зависит от концентрации лимитирующего субстрата и оп­ределяется уравнением

(4)

 

Достаточно часто удельная скорость роста клеточной куль­туры зависит от концентрации лимитирующего субстрата и оп­ределяется уравнением

(5)

В этом случае наиболее удобным представляется ана­лиз экспериментальных дан­ных в двойных обратных ко­ординатах, пере­ход к которым описывается уравнением

 

(6)

 

1.4.Ингибирование и активация клеточного роста

 

Практически для всех клеточных популяций характерно из­менение скорости роста под действием ингибиторов и активато­ров.

Классификация ингибиторов и активаторов:

1. По «мишени», на которую действует вещество: а) ингибито­ры, действующие на ДНК, например налидиксоновая кислота; б) ингибиторы, действующие на РНК, например актиномицин D; в) ингибиторы синтеза белка, например хлорамфеникол (левомицетин), эритромицин, тетрациклин; г) ингибиторы син­теза клеточной стенки, например пенициллин; д) мембраноак­тивные вещества, например толуол, хлороформ; е) ингибиторы энергетических процессов, например 2,4-динитрофенол; ж) ингибиторы лимитирующего фермента. Таких веществ доста­точно много. Чувствительность ферментов к их действию зависит от природы функциональных групп активного центра конкрет­ного фермента.

2. По кинетике действия: а) необратимые ингибиторы и акти­ваторы; б) обратимые ингибиторы и активаторы.

Следует заметить, что для кинетики роста клеток также ха­рактерно наличие процессов ингибирования избытком субстра­та и продуктом. Удельная скорость роста клеточной культуры в этом случае описывается следующим уравнением:

(7)

Рассмотрим наиболее важные с точки зрения кинетики кле­точного роста случаи ингибирования и активации.

1. Полное конкурентное ингибирование (α→∞,β = 0). В этом случае удельная скорость роста клеток описывается уравнением

(8)

В двойных обратных координатах наблюдается пучок прямых, пересекающихся на оси ординат (рис. 1.5.).

2. Полное неконкурентное ингибирование (α = 1, β = 0). В этом случае удельная скорость роста культуры определяется выраже­нием

Рис. 1.5. Полное конкурентное ин­гибирование клеточного роста.

Рис. 1.6. Полное неконкурентное ингибирование клеточного роста.

 

 

(9)

При этом в двойных обратных координатах наблюдается пу­чок прямых, пересекающихся на оси абсцисс.

3. Неконкурентная активация (α = 1, β > 1). Максимальная скорость роста в этом случае увеличивается:

(10)

В двойных обратных координатах данный случай практически неотличим от случая неконкурентного ингибирования (рис. 1.6.).

4. Смешанные типы ингибирования и активации1, β1).

 

 

2. Влияние pH на кинетику клеточного роста

 

Одним из важнейших факторов, определяющих кинетику кле­точного роста, являются ионы водорода. Многие клеточные куль­туры растут в достаточно узком диапазоне pH; изменение pH приводит к замедлению их скорости роста или к полному прекращению роста. Влияние концен­трации ионов водорода на скорость роста кле­точных культур - дос­таточно сложное явление. Изменение pH может затрагивать многие сто­роны функционирова­ния клетки. Прежде всего кон­центрация ионов водо­рода может изменять состояние субстрата, если субстрат содержит ионогенную группу. Например, весьма рас­пространенная группа субстратов - амино­кислоты -содержит две ионогенные группы.

Поэтому присоедине­ние ионов водорода может существенным образом менять заряд аминокислоты, ее проницаемость через клеточную мембрану.

Следовательно, при анализе pH-зависимости роста клеток следует в первую очередь анализировать pH-зависимость лими­тирующего субстрата.

 

 

Другим фактором, определяющим pH-зависимость скоро­сти роста клеток, является чувствительность ферментов к кон­центрации ионов водорода.

Характерной особенностью живых клеток является различие концентраций ионов водорода вне клетки и в клетке.

Простейшую модель, описывающую этот факт, можно пред­ставить следующим образом. Пусть мембрана микробной клетки частично проницаема для ионов водорода. Тогда кинетика пере­носа ионов водорода через мембрану может быть представлена следующим образом:

 

где и-концентрация ионов водорода в клетки и вне нее; α и β – коэффициенты пропорциональности.

В условиях равновесия

Если α/β> 1, то в клетке поддерживается более кислая среда, чем вне ее, иначе — в клетке среда более щелочная.

 

 

 

3. ……………..

Микроорганизмы в процессе своего роста образуют колонии, характеризующиеся определенной массой и активностью. Образование колоний микроорганизмов на поверхности полимерного материала подчиняется закономерностям.

Развитие колоний проходит шесть фаз, длительность которых зависит от свойств микроорганизмов и материала, на котором происходит их рост, и условий среды. После периода некоторой задержки (лаг-фззы) наблюдается ускорение роста экспоненциальный рост, затем происходит замедление роста из-за нехватки источников питания, накопления ингибирующих продуктов или из-за изменения условий среды. По достижении максимума прироста наступает стационарная фаза V, которая характеризуется постоянством биомассы, затем происходит заключительная стадия (VI), связанная с уменьшением биомассы в результате метаболических процессов и отмиранием микроорганизмов.

Для биоповреждений наибольшее значение с точки зрения развития процесса имеют первые две фазы, а с точки зрения накопления биомассы и продуктов метаболизма, стимулирующих другие процессы (коррозии металлов и старения полимеров и покрытий), - последующие две.

Кинетические характеристики могут быть выражены дифференциальной моделью в общем виде:

 

Адсорбция, а затем проникновение органических кислот в полимер стимулируют развитие трещин в напряженных материалах. Такие явления могут привести к отказам в результате полной потери прочности конструкционных полимеров.

Старение приводит к изменениям химических и физических свойств полимеров, что способствует проникновению гифов грибов в материалы и использованию низкомолекулярных продуктов деструкции как источника питания. С другой стороны, накопление продуктов метаболизма стимулирует процесс старения по механизму химического, окислительного и других видов разрушения.

0.4 Остановка роста, апоптоз и гибель клеток

 

В развитии любой клеточной популяции наступает период остановки клеточного роста и гибели клеток. Очевидно, что оста­новка роста и гибель клеток имеют не меньшее значение, чем их размножение и рост. Особенно эти процессы важны для много­клеточных организмов. Неудержимый и неконтролируемый рост отдельных клеток — причина онкологических заболеваний, ос­тановка роста, старение и гибель клеток — причина старения и смерти организма в целом.

Различные популяции и различные клетки ведут себя совер­шенно по-разному. Бактериальные клетки и клетки одноклеточ­ных организмов внешне представляются «бессмертными». При попадании в подходящую комфортную среду с избытком лими­тирующего субстрата клетки начинают активно размножаться. Ограничение их роста определяется расходом субстрата, накоп­лением продуктов-ингибиторов, а также специфическим меха­низмом ограничения роста, который мы назвали «прогрессиру­ющая некомпетентность».Клетки многоклеточных организмов ведут себя совершенно по-другому. Дифференцированные клетки составляют органы и ткани, и их рост и размножение принципиально ограничены. Если механизм контроля роста разрушается, возникают индиви­дуальные клетки, растущие неограниченно. Эти клетки составля­ют популяцию раковых клеток, их рост приводит к гибели орга­низма в целом.

 

 

 

 

 

 

 

 

Share

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

38 − 30 =