лит обзор


МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ

 

Государственное образовательное учреждение
высшего п
рофессионального образования
«Т
амбовский государственный университет

Имени Г.Р. Державина»

 

Институт математики, физики и информатики

 

ОТЧЕТ

о прохождении производственной практики

 

Исследование динамики роста микроорганизмов

 

 

место прохождения практики: Кафедра теоретической и экспериментальной физики ИМФИ ТГУ им. Г.Р. Державина

 

период прохождения практики: с « » декабря 2012 г. по « » декабря 2012 г.

 

 

 

Студент: 52 группы Чуфистова Елена Алексеевна

Руководитель: к. ф.-м. н., доцент Желтов М.А.

 

 

 

Тамбов 2012

Содержание

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Введение

Одно из первичных и основных свойств мельчайших живых клеток - рост и размножение микроорганизмов. В силу этого кинетика и стехиометрия роста микроорганизмов составляет основу количественного анализа микробиологических процессов. Микробиологические процессы составляют суть, с одной стороны, многих промышленных технологий синтеза биомассы, биологически активных веществ, а с другой, стадии деструкции в природном круговороте веществ.

При наблюдении за процессами роста микроорганизмов и трансформации вещества в природных системах соблюсти условия воспроизведения параметров внешней среды трудно. Ограниченность наших знаний позволяет с большим основанием сказать, что теория роста популяций микроорганизмов, построенная на базе данных управляемого биосинтеза микроорганизмов и для решения прикладных задач, оказывается недостаточно глубоко проработанной, чтобы с таким же успехом решать экологические задачи [93]. При строгом рассмотрении экспериментальных данных не только природные, но и процессы в управляемых или контролируемых условиях существенно отличаются от прогноза, который дает его математическая модель (количественное описание). В связи с этим следует обратить внимание на сложный характер процесса размножения микроорганизмов [18, 91].

Один из реальных путей построения адекватного представления об этом явлении заключается в изучении областей существования микробных популяций с особыми типами роста популяций микроорганизмов. Модель роста популяции (математическая и физическая) должна быть поддержана детальным рассмотрением значимых, в смысле регуляторных свойств, физиолого-биохимических характеристик биологического объекта и отнесением его к определенному типу процессов роста микроорганизмов.

Целью данной работы является описание особенностей кинетики роста микроорганизмов, как динамических систем и на основе качественной теории роста микробных популяций, и экспериментальное обоснование теоретических выводов разработками биотехнологий. Для выделения областей особого поведения популяций микроорганизмов в работе проводится классификация характеристик их роста. Затем популяция с определенным типом роста рассматривается как динамическая система взаимодействующих организмов и среды (субстрата, продуктов его превращения или метаболитов и других переменных). Детализация на биохимическом и генетическом уровнях описания резко увеличивает сложность (размерность) анализируемой системы, что позволяет делать почти любые выводы. Поэтому для объяснения расхождения наблюдаемых и прогнозируемых результатов усложнение моделей проводится последовательно, рассматриваются различные биофизические механизмы регуляции плотности популяции микроорганизмов, независимо от формы записи функции размножения. Типизация и усложнение моделей роста микроорганизмов (в рамках универсальной модели Моно) и сопоставление их с найденными в соответствующей области примерами нетипичного поведения составляют методологическую основу исследования особенностей кинетики роста микробных популяций в настоящей работе.

 

 

 

 

 

 

 

1. Клеточный рост

1.1. Клеточный цикл

Изучение кинетических особенностей развития клеточных популяций невозможно без понимания закономерностей раз­вития одной клетки. Эти закономерности описываются кле­точным циклом, который состоит по крайней мере из четы­рех фаз (рис. 1.1):

1. Митоз (М-фаза). В этой фазе происходит деление материнс­кой клетки на две дочерние.

2. -фаза-период времени между концом М-фазы и нача­лом синтеза ДНК.

3. S-фаза -период синтеза ДНК.

4. -фаза-период между концом S-фазы и началом M-фазы.

Совокупность G1, S-и G2-фаз принято называть интерфазой.

 

Длительность клеточно­го цикла подвержена значи­тельным вариациям и может составлять от 1-2 ч (для эм­бриональных, микробных клеток) до нескольких де­сятков лет (гепатоциты, нейроны).

 

Рис. 1.1. Клеточный цикл

 

В основном различия в длительности клеточных циклов связаны с различи­ями в длительности G1-фазы.

У однотипных клеток могут происходить случайные из­менения длительности G1-фазы, приводящие к десинхронизации процессов кле­точного деления, даже если изначально процессы клеточного деления были синхронизиро­ваны.

 

1.2. Типичная кривая роста клеточной культуры

При занесении бактерий в питательную среду они обычно растут до тех пор, пока содержание какого-нибудь из необходимых им компонентов среды не достигнет минимума, после чего рост прекращается. Если на протяжении этого времени не добавлять питательных веществ и не удалять конечных продуктов обмена, то получим так называемую периодическую культуру (популяцию клеток в ограниченном жизненном пространстве). Рост в такой «закрытой системе» подчиняется закономерностям, действительным не только для одноклеточных, но и для многоклеточных организмов. Периодическая культура ведет себя как многоклеточный организм с генетически ограниченным ростом.

Кривая, описывающая зависимость логарифма числа живых клеток от времени, называется кривой роста. Типичная кривая роста (рис. 1.2) имеет S-образную форму и позволяет различить несколько фаз роста, сменяющих друг друга в определенной последовательности и в большей или меньшей степени выраженных: начальную (или лаг-) фазу, экспоненциальную (или логарифмическую) фазу, стационарную фазу и фазу отмирания.

Рис.1.2. Кривая роста бактериальной культуры

1.Начальная фаза. Эта фаза охватывает промежуток времени между инокуляцией и достижением максимальной скорости деления. Продолжительность этой фазы зависит главным образом от предшествовавших условий культивирования и возраста инокулята, а также от того, насколько пригодна для роста данная среда. Если инокулят взят из старой культуры (в стационарной фазе роста), то клеткам приходится сначала адаптироваться к новым условиям путем синтеза РНК, образования рибосом и синтеза ферментов. Если источники энергии и углерода в новой среде отличаются от тех, какие были в предшествующей культуре, то приспособление (адаптация) к новым условиям может быть связано с синтезом новых ферментов, которые ранее не были нужны и поэтому не синтезировались. Образование новых ферментов индуцируется новым субстратом.

2.Экспоненциальная фаза. Экспоненциальная (логарифмическая) фаза роста характеризуется постоянной максимальной скоростью деления клеток. Эта скорость во время экспоненциальной фазы зависит от вида бактерий, а также от среды. Энтеробактерии делятся через каждые 15-30 мин. У других бактерий время генерации значительно больше: у многих почвенных видов оно достигает 60-150 мин, а у некоторых даже 5-10 ч.

Величина клеток и содержание в них белка у многих бактерий тоже остаются в экспоненциальной фазе постоянными. В известном смысле можно сказать, что бактериальная культура в этом случае состоит из «стандартных клеток». Если точно установлено, что число клеток, содержание в них белка и их сухая биомасса увеличиваются с одинаковой скоростью, то за ростом культуры можно следить, пользуясь каким-нибудь одним из этих показателей. Нередко, однако, и в экспоненциальной фазе роста клетки периодической культуры претерпевают изменения, так как постепенно изменяется среда: уменьшается концентрация субстрата, увеличивается плотность клеточной суспензии и накапливаются продукты обмена. В связи с тем, что в экспоненциальной фазе скорость деления клеток относительно постоянна, эта фаза наиболее удобна для определения скорости деления (и скорости роста). Изучая влияние факторов среды (рН, окислительно-восстановительного потенциала, температуры, аэрации и т. д.), а также пригодность различных субстратов, следят за увеличением числа клеток или за мутностью (экстинкцией) клеточной суспензии во время экспоненциального роста.

3.Стационарная фаза. Стационарная фаза наступает тогда, когда число клеток перестает увеличиваться. Скорость роста зависит от концентрации субстрата при уменьшении этой концентрации, еще до полного использования субстрата, она начинает снижаться. Поэтому переход от экспоненциальной фазы к стационарной происходит постепенно. Скорость роста может снижаться не только из-за нехватки субстрата, но также из-за большой плотности бактериальной популяции, из-за низкого парциального давления или накопления токсичных продуктов обмена; все эти факторы вызывают переход к стационарной фазе. И в стационарной фазе могут еще происходить такие процессы, как использование запасных веществ, распад части рибосом и синтез ферментов. Наблюдаемая картина зависит от того, какой именно фактор лимитирует рост. Быстро гибнут лишь очень чувствительные клетки; другие еще долго сохраняют жизнеспособность - до тех пор, пока есть возможность получать необходимую для этого энергию в процессе окисления каких-либо запасных веществ или клеточных белков.

4.Фаза отмирания. Фаза отмирания и причины гибели бактериальных клеток в нормальных питательных средах изучены недостаточно. Сравнительно легко понять случаи, когда в среде накапливаются кислоты. Число живых клеток может снижаться экспоненциально. Иногда клетки лизируются под действием собственных ферментов (автолиз).

Последовательные переходы от фазы 1 к фазе 4 наблюдаются в значительной степени за счет истощения субстратов, необхо­димых для роста популяции клеток, или же за счет накопления токсичных продуктов их жизнедеятельности.

Впервые на лимитирование процессов роста культур клеток субстратами ферментативных реакций обратил внимание Ж. Моно. Субстраты, ограничивающие рост микробных популяций, по­лучили название лимитирующих.

Было показано, что зависимость скорость роста клеточной культуры от концентрации лимитирующего субстрата можно представить в следующем виде:

 

где Nчисло микробных клеток; µm — коэффициент пропорци­ональности, получивший название предельная максимальная удель­ная скорость роста, Ks параметр, характеризующий сродство субстрата к клеткам культуры.

 

Достаточно часто вводят следующее обозначение:

Тогда µ-является коэффициентом пропорциональности, ха­рактеризующим клеточный рост. Его принято называть удельной скоростью роста. Размерность удельной скорости роста - обрат­ное время: мин-1, ч-1 и т.д.

На основании литературных данных было показано, что величины варьируют в пределах 10-2 — 10-5 с1, а значения Ks в диапазоне 10-2 — 10-8 М (рис. 1.3). Как следует из рисунка, величины Кг практически полностью соответствуют наблюдае­мым значениям констант Михаэлиса.

Среднее значение µт составляет порядка 10-4 с-1. Исходя из стандартного соотношения между константой скорости первого по­рядка и временем удвоения численности клеточной популяции, видно, что среднее время увеличения клеточной популяции вдвое составляет около 2 ч.

Рис.1.3. Плотность распределения кинетических параметров ферментных реакций kкат, Кт и кинетических параметров клеточного роста µm, КS

Размерность kкат µm,с-1Кm, KsМ.

 

 

На практике отсутствуют клетки с µm выше 10-2 и ниже 10-6 с. Верхний предел скорости роста клеточных популяций связан со скоростью процессов репликации (удвоения) ДНК клеточного цикла. Нижний предел скорости роста, по-видимо­му, связан с малой жизнеспособностью медленно растущих по­пуляций.

 

1.3 Экспоненциальная фаза роста клеточных культур

 

В условиях, когда концентрация субстратов и других компо­нентов, необходимых для роста клеток постоянна, процесс увеличе­ния числа клеток носит автокаталитический характер. Данный про­цесс описывается следующим дифференциальным уравнением:

 

(1)

 

где N — число клеток, µ — удельная скорость роста.

Дифференциальное уравнение (1) является уравнением с разделяющимися переменными. Оно легко может быть решено:

(2)

где N0 — начальное число клеток.

Уравнение (2) описывает экспоненциальную фазу роста клеточных культур. В полулогарифмических координатах данное уравнение может быть представлено следующим об­разом:

(3)

Рис.1.4. Определение кинетических параметров роста клеточной культуры.

 

Таким образом, анализ эк­спериментальных данных по исследованию кинетики рос­та клеточных популяций сле­дует начинать в полулогариф­мических координатах. Если в этих координатах наблюдает­ся спрямление эксперимен­тальных данных, то они опи­сываются уравнением (1.4.).

Тангенс угла наклона прямой равен удельной скорости роста клеточной культуры, а ордината точки пересечения графика с осью Y равна начальному числу клеток в культуре (рис. 1.4.).

Достаточно часто удельная скорость роста клеточной куль­туры зависит от концентрации лимитирующего субстрата и оп­ределяется уравнением

(4)

 

Достаточно часто удельная скорость роста клеточной куль­туры зависит от концентрации лимитирующего субстрата и оп­ределяется уравнением

(5)

В этом случае наиболее удобным представляется ана­лиз экспериментальных дан­ных в двойных обратных ко­ординатах, пере­ход к которым описывается уравнением

 

(6)

 

1.4.Ингибирование и активация клеточного роста

 

Практически для всех клеточных популяций характерно из­менение скорости роста под действием ингибиторов и активато­ров.

Классификация ингибиторов и активаторов:

1. По «мишени», на которую действует вещество: а) ингибито­ры, действующие на ДНК, например налидиксоновая кислота; б) ингибиторы, действующие на РНК, например актиномицин D; в) ингибиторы синтеза белка, например хлорамфеникол (левомицетин), эритромицин, тетрациклин; г) ингибиторы син­теза клеточной стенки, например пенициллин; д) мембраноак­тивные вещества, например толуол, хлороформ; е) ингибиторы энергетических процессов, например 2,4-динитрофенол; ж) ингибиторы лимитирующего фермента. Таких веществ доста­точно много. Чувствительность ферментов к их действию зависит от природы функциональных групп активного центра конкрет­ного фермента.

2. По кинетике действия: а) необратимые ингибиторы и акти­ваторы; б) обратимые ингибиторы и активаторы.

Следует заметить, что для кинетики роста клеток также ха­рактерно наличие процессов ингибирования избытком субстра­та и продуктом. Удельная скорость роста клеточной культуры в этом случае описывается следующим уравнением:

(7)

Рассмотрим наиболее важные с точки зрения кинетики кле­точного роста случаи ингибирования и активации.

1. Полное конкурентное ингибирование (α→∞,β = 0). В этом случае удельная скорость роста клеток описывается уравнением

(8)

В двойных обратных координатах наблюдается пучок прямых, пересекающихся на оси ординат (рис. 1.5.).

2. Полное неконкурентное ингибирование (α = 1, β = 0). В этом случае удельная скорость роста культуры определяется выраже­нием

Рис. 1.5. Полное конкурентное ин­гибирование клеточного роста.

Рис. 1.6. Полное неконкурентное ингибирование клеточного роста.

 

 

(9)

При этом в двойных обратных координатах наблюдается пу­чок прямых, пересекающихся на оси абсцисс.

3. Неконкурентная активация (α = 1, β > 1). Максимальная скорость роста в этом случае увеличивается:

(10)

В двойных обратных координатах данный случай практически неотличим от случая неконкурентного ингибирования (рис. 1.6.).

4. Смешанные типы ингибирования и активации1, β1).

 

 

2. Влияние pH на кинетику клеточного роста

 

Одним из важнейших факторов, определяющих кинетику кле­точного роста, являются ионы водорода. Многие клеточные куль­туры растут в достаточно узком диапазоне pH; изменение pH приводит к замедлению их скорости роста или к полному прекращению роста. Влияние концен­трации ионов водорода на скорость роста кле­точных культур - дос­таточно сложное явление. Изменение pH может затрагивать многие сто­роны функционирова­ния клетки. Прежде всего кон­центрация ионов водо­рода может изменять состояние субстрата, если субстрат содержит ионогенную группу. Например, весьма рас­пространенная группа субстратов - амино­кислоты -содержит две ионогенные группы.

Поэтому присоедине­ние ионов водорода может существенным образом менять заряд аминокислоты, ее проницаемость через клеточную мембрану.

Следовательно, при анализе pH-зависимости роста клеток следует в первую очередь анализировать pH-зависимость лими­тирующего субстрата.

 

 

Другим фактором, определяющим pH-зависимость скоро­сти роста клеток, является чувствительность ферментов к кон­центрации ионов водорода.

Характерной особенностью живых клеток является различие концентраций ионов водорода вне клетки и в клетке.

Простейшую модель, описывающую этот факт, можно пред­ставить следующим образом. Пусть мембрана микробной клетки частично проницаема для ионов водорода. Тогда кинетика пере­носа ионов водорода через мембрану может быть представлена следующим образом:

 

где и-концентрация ионов водорода в клетки и вне нее; α и β – коэффициенты пропорциональности.

В условиях равновесия

Если α/β> 1, то в клетке поддерживается более кислая среда, чем вне ее, иначе — в клетке среда более щелочная.

 

 

 

3. ……………..

Микроорганизмы в процессе своего роста образуют колонии, характеризующиеся определенной массой и активностью. Образование колоний микроорганизмов на поверхности полимерного материала подчиняется закономерностям.

Развитие колоний проходит шесть фаз, длительность которых зависит от свойств микроорганизмов и материала, на котором происходит их рост, и условий среды. После периода некоторой задержки (лаг-фззы) наблюдается ускорение роста экспоненциальный рост, затем происходит замедление роста из-за нехватки источников питания, накопления ингибирующих продуктов или из-за изменения условий среды. По достижении максимума прироста наступает стационарная фаза V, которая характеризуется постоянством биомассы, затем происходит заключительная стадия (VI), связанная с уменьшением биомассы в результате метаболических процессов и отмиранием микроорганизмов.

Для биоповреждений наибольшее значение с точки зрения развития процесса имеют первые две фазы, а с точки зрения накопления биомассы и продуктов метаболизма, стимулирующих другие процессы (коррозии металлов и старения полимеров и покрытий), - последующие две.

Кинетические характеристики могут быть выражены дифференциальной моделью в общем виде:

 

Адсорбция, а затем проникновение органических кислот в полимер стимулируют развитие трещин в напряженных материалах. Такие явления могут привести к отказам в результате полной потери прочности конструкционных полимеров.

Старение приводит к изменениям химических и физических свойств полимеров, что способствует проникновению гифов грибов в материалы и использованию низкомолекулярных продуктов деструкции как источника питания. С другой стороны, накопление продуктов метаболизма стимулирует процесс старения по механизму химического, окислительного и других видов разрушения.

0.4 Остановка роста, апоптоз и гибель клеток

 

В развитии любой клеточной популяции наступает период остановки клеточного роста и гибели клеток. Очевидно, что оста­новка роста и гибель клеток имеют не меньшее значение, чем их размножение и рост. Особенно эти процессы важны для много­клеточных организмов. Неудержимый и неконтролируемый рост отдельных клеток — причина онкологических заболеваний, ос­тановка роста, старение и гибель клеток — причина старения и смерти организма в целом.

Различные популяции и различные клетки ведут себя совер­шенно по-разному. Бактериальные клетки и клетки одноклеточ­ных организмов внешне представляются «бессмертными». При попадании в подходящую комфортную среду с избытком лими­тирующего субстрата клетки начинают активно размножаться. Ограничение их роста определяется расходом субстрата, накоп­лением продуктов-ингибиторов, а также специфическим меха­низмом ограничения роста, который мы назвали «прогрессиру­ющая некомпетентность».Клетки многоклеточных организмов ведут себя совершенно по-другому. Дифференцированные клетки составляют органы и ткани, и их рост и размножение принципиально ограничены. Если механизм контроля роста разрушается, возникают индиви­дуальные клетки, растущие неограниченно. Эти клетки составля­ют популяцию раковых клеток, их рост приводит к гибели орга­низма в целом.

 

 

 

 

 

 

 

 

Share

Лит обзор ФХ методы анализа


МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
«Российский химико-технологический университет им. Д.И.Менделеева».

 

Факультет

химико-фармацевтических

технологий и биомедицинских

препаратов

Кафедра

технологии химико-фармацевтических

и косметических средств

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

«Физико-химические методы оценки качества эфирных масел».

 

Учебный предмет: Технология эфирных масел

 

Выполнил: студент группы О-45
Графов Д. А.

Проверила: кандидат химических наук,
асс. Тихонова Т. В.

 

 

 

 

 

Москва 2014

 

Содержание

Введение…………………………………………………………………… 3

1. Физические методы анализа эфирных масел……………………….....4

2. Химические методы анализа…………………………………………... 9

2.1 Анизидиновое число………………………………………………....9

2.2 Гидроксильное число………………………………………………...10

2.3 Йодное число…………………………………………………………14

2.4 Кислотное число……………………………………………………...16

3. Физико-химические методы анализа…………………………………... 18

3.1 Хроматография……………………………………………………… 18

3.1.1 Газожидкостная хроматография………………………………...19

3.1.2 Тонкослойная хроматография…………………………………...22

3.1.3 Высокоэффективная жидкостная хроматография……………...24

4. Заключение………………………………………………………………...28

5. Список литературы………………………………………………………..29

 

 

 

 

 

 

 

 

Введение

Эфирные масла (Olea aetherea) смесь душистых летучих ве­ществ, образующихся в растениях и относящихся к различным классам органических соединений, преимущественно терпеноидам (кислородные соединения терпенов), реже к ароматическим и али­фатическим соединениям. Среди них встречаются углеводороды, спирты, кетоны, альдегиды, фенолы, лактоны, кислоты, простые и сложные эфиры и др.

Свое название эфирные масла получили благодаря наличию характерного ароматного запаха и маслообразной консистенции. В отличие от жирных масел они испаряются, не оставляя жирного пятна. Эфирные масла широко распространены в растительном мире. В настоящее время известно до 2500 эфирномасличных расте­ний, относящихся к различным классам — от низших до покрыто­семянных. При этом ряд семейств выделяется особенно большим числом эфирномасличных растений; это астровые (сложноцветные), яснотковые (губоцветные), сельдерейные (зонтичные), миртовые, лавровые, розоцветные и др.

Эфирные масла могут накапливаться в любых органах растений: цветках розы и лаванды, плодах сельдерейных и цитрусовых, листьях яснотковых, в подземных органах аира, ириса, девясила. Их содержание для различных растений составляет от тысячных долей процента до 5 %, а для некоторых видов, например бутонов гвоздичного дерева, — 20 %.

В зависимости от сферы применения эфирных масел они имеют разные характеристики, и к ним применяются соответствующие требования, отражённые в стандартах, технических условиях и др. документах. Для эфирных масел, используемых в производстве лекарств, сборником стандартов является Фармакопея. Т. н. «therapeutic grade» продукты, распространённые на Западе, не имеют формального стандартного описания —  декларируется лишь то, что в их производстве не использовались синтетические пестициды и удобрения.

Поэтому, как и в анализе лекарственных и фармацевтических субстанций используются современные методы анализа. Основные методы подразделяются на 3 большие группы:

1. Физические методы анализа

2. Химические методы анализа

3. Физико-химические методы анализа

 

1. Физические методы анализа эфирных масел

Подлинность испытуемого масла устанавливают, определяя цвет, запах и вкус масла.

Визуальные показатели

0.1 Цвет

Цвет устанавливают, поместив 10 мл масла в цилиндр из прозрачного бесцветного стекла диаметром 2—3 см, наблюдая в проходящем свете.

 

1.2 Запах

Запах определяют следующим образом: 0,1 мл (2 капли) масла наносят на полоску фильтровальной бумаги длиной около 12 см и шириной б см так, чтобы масло не смачивало края бумаги, и срав­нивают запах испытуемого образца через каждые 15 мин с запахом контрольного образца, нанесенного таким же образом на фильтро­вальную бумагу. В течение 1 ч запах должен быть одинаков с за­пахом контрольного образца.

1.3 Вкус

Вкус устанавливают, прикладывая к языку полоску фильтро­вальной бумаги с нанесенной на нее каплей масла или крупинку смеси 1 г сахарной пудры с 1 каплей испытуемого масла.

Числовые показатели

1.4 Температура затвердевания (ОФС 42-0035-07)

Температуру затвердевания определяют в «специальном приборе» состоящем из сосуда с охлаждающей смесью, в который помещают пробирку с испытуемым маслом. Высота слоя масла должна состав­лять не менее 5 см. С помощью термометра отмечают наиболее высо­кую температуру, остающуюся короткое время постоянной с мо­мента застывания вещества, и принимают ее за температуру застывания.

 

1.5 Плотность (ОФС 42-0037-07)

Плотностью называют массу единицы объема вещества. Если массу m измеряют в граммах, а объем V в кубических сантиметрах, то плотность представляет собой массу 1 см3 вещества: ρ г/см3. Плотность вещества ρ20 является отношением массы вещества к его объему при температуре 20 °С.

Определение плотности проводят с помощью пикнометра, ареометра или плотномера.

 

 

1.6 Вязкость (ОФС 42-0038-07)

Вязкость (внутреннее трение) свойство текучих тел оказывать сопротивление перемещению одной их части относительно другой.

Основными кинематическими переменными для жидкостей служат деформация и ее скорость. Поэтому для изучения реологических характеристик жидких сред устанавливают связь между приложенными внешними нагрузками и кинематическими параметрами.

Жидкости, вязкость которых не зависит от напряжения сдвига и при определенной концентрации и температуре является постоянной величиной в соответствии с законом Ньютона, называются ньютоновскими. Неньютоновские жидкости не следуют закону Ньютона, их вязкость зависит от напряжения сдвига.

Различают динамическую, кинематическую, относительную, удельную, приведенную и характеристическую вязкости. Для неньютоновских жидкостей, главным образом, характерна структурная вязкость. Структурная (эффективная или кажущаяся) вязкость вязкость при данном напряжении сдвига.

Динамическая вязкость или коэффициент вязкости (η) это приходящаяся на единицу поверхности тангенциальная сила, называемая также напряжением сдвига (τ), выраженная в паскалях (Па), которую необходимо приложить для того, чтобы переместить слой жидкости площадью 1 м2 со скоростью (v) 1 метр в секунду (м×c-1), находящийся на расстоянии (х) 1 метр относительно другого слоя, параллельно плоскости скольжения.

Величина dv/dx представляет собой градиент скорости и определяет скорость сдвига D, выраженную в обратных секундах -1). Таким образом,

η = τ / D.   (1)

Динамическую вязкость (η) обычно выражают в пуазах (пз) или сантипуазах (1 спз = 0,01 пз). Жидкость имеет вязкость 1 пз, если напряжение сдвига 1 дин/см2 создает скорость сдвига 1 с-1. В системе СИ динамическая вязкость выражается в паскаль-секундах (Па×с) или миллипаскаль-секундах (мПа×с). 1 сП = 1 мПа×с.

Кинематическую вязкость (ν), выраженную в метрах квадратных на секунду (м2×с-1), получают делением величины динамической вязкости η на плотность жидкости ρ, выраженную в килограммах на метр кубический (кг×м-3), измеренную при той же температуре:

 

v = η / ρ.   (2)

Кинематическую вязкость обычно выражают в стоксах (ст) или сантистоксах (1 сст = 0,01 ст), в системе СИ в метрах квадратных на секунду (м2×с –1) или миллиметрах квадратных на секунду (мм2×с –1).

1 ст = 10-4 м2×с-1.

В ряде случаев требуется определить вязкость одной жидкости относительно другой – относительную вязкость ( ηотн.).

Часто вязкость выражают как удельную вязкость (ηуд), которая показывает, какая часть вязкости раствора обусловлена присутствием в нем растворенного

вещества:

 

где: η вязкость раствора;

ηо вязкость растворителя.

Удельная вязкость, отнесенная к единице концентрации раствора, называется приведенной вязкостью (ηприв ):

 

   (4)

 

где: с концентрация раствора.

Для растворов полимеров вязкость является функцией молекулярных масс, формы, размеров и гибкости макромолекул. Чтобы определить структурные характеристики полимеров, приведенную вязкость экстраполируют к нулевой концентрации. В этом случае вводится понятие характеристической вязкости [η]:

Характеристическая вязкость выражается в единицах, обратных единицам концентрации.

Для определения вязкости применяются капиллярные, ротационные вискозиметры и вискозиметры с падающим шариком.

Капиллярные вискозиметры обычно используются для определения вязкости при одном значении скорости сдвига, поэтому применяются в основном для исследования ньютоновских жидкостей. Они просты и удобны в обращении.

Ротационные вискозиметры позволяют определять реологические свойства жидкостей в широком диапазоне скоростей сдвига, что особенно важно для неньютоновских жидкостей.

1.7 Рефрактометрия (ОФС 42-0040-07)

Показателем преломления (индексом рефракции) называют отношение скорости света в вакууме к скорости света в испытуемом веществе (абсолютный показатель преломления). На практике определяют так называемый относительный показатель преломления (n), который является отношением скорости света в воздухе к скорости света в испытуемом веществе.

Показатель преломления зависит от температуры и длины волны света, при которой проводят определение. В растворах показатель преломления зависит также от концентрации вещества и природы растворителя.

Рефрактометрию применяют для установления подлинности и чистоты вещества. Метод применяют также для определения концентрации вещества в растворе, которую находят по графику зависимости показателя преломления раствора от концентрации. На графике выбирают интервал концентраций, в котором наблюдается линейная зависимость между показателем преломления и концентрацией. В этом интервале концентрацию вычисляют по формуле:

 

X = (n - no)/F,

где: X концентрация, в процентах;

n – показатель преломления раствора;

nо – показатель преломления растворителя при той же температуре;

F фактор, равный величине прироста показателя преломления при увеличении концентрации на 1 % (устанавливается экспериментально).

 

Для определения показателя преломления применяют рефрактометры. Определение проводят при температуре (20 ± 0,5) ºС и длине волны линии D спектра натрия (589,3 нм). Показатель преломления, определенный при таких условиях, обозначается индексом   .

Современные приборы откалиброваны таким образом, что отсчеты, полученные по их шкалам, соответствуют показателям преломления для D линии спектра натрия. При проведении измерений следует соблюдать указания в отношении соответствующего источника света, приведенные в инструкции к прибору. Если используют белый свет, то рефрактометр снабжен компенсирующей системой.

Цена деления термометра не должна превышать 0,5 ºС.

Обычно измерения показателя преломления проводят на рефрактометрах Аббе, в основу которых положено явление полного внутреннего отражения при прохождении светом границы раздела двух сред с разными показателями преломления. Диапазон измеряемых показателей преломления при измерении в проходящем свете 1,3-1,7. Точность измерения показателя преломления должна быть не ниже ±2×10-4.

Могут быть использованы рефрактометры других типов с такой же или большей точностью.

 

 

 

 

2.Химические методы анализа

 

2.1 Анизидиновое число (ОФС 42-0119-09)

Анизидиновым числом (IAH) называется число, определяющее содержание в испытуемом веществе (масло, твердые жиры, липиды) вторичных продуктов окисления (альдегидов, кетонов), равное увеличенной в 100 раз оптической плотности, измеренной в кювете с толщиной слоя 1 см раствора, содержащего 1 г испытуемого вещества в 100 мл смеси растворителей после реакции с п-анизидином в условиях стандартизованной методики.

Операции с растворами проводят быстро, избегая воздействия яркого света.

Испытуемый раствор А. Если не указано иначе в частной фармакопейной статье, навеску 0,500 г испытуемого вещества помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяют в триметилпентане, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают.

Испытуемый раствор Б. К 5,0 мл испытуемого раствора А прибавляют 1,0 мл 0,25 % раствора п-анизидина в уксусной кислоте ледяной и встряхивают.

Раствор сравнения. К 5,0 мл триметилпентана прибавляют 1,0 мл
0,25 % раствора
п-анизидина в уксусной кислоте ледяной и встряхивают.

Методика. Измеряют оптическую плотность испытуемого раствора А в максимуме поглощения при длине волны 350 нм относительно триметилпентана. Измеряют оптическую плотность испытуемого раствора Б в максимуме поглощения при длине волны 350 нм ровно через 10 мин после его приготовления относительно раствора сравнения.

Анизидиновое число рассчитывают по формуле:

,

 

где:   А1 – оптическая плотность испытуемого раствора Б;

А2 – оптическая плотность испытуемого раствора А;

а – навеска испытуемого вещества в испытуемом растворе А, в граммах.

Примечание. Раствор п-анизидина используют свежеприготовленным.

2.2 Гидроксильное число (ОФС 42-0120-09).

Гидроксильным числом (IOH) называют количество миллиграммов калия гидроксида, эквивалентное суммарному количеству кислоты, присутствующей в растворе после ацилирования 1 г испытуемого вещества.

Гидроксильное число характеризует число гидроксильных групп в веществе.

Метод 1.

Если не указано иначе в частной фармакопейной статье, точную навеску испытуемого вещества, указанную в табл. 25.1, помещают в колбу вместимостью 150 мл, снабженную воздушным холодильником. Прибавляют
25 % раствор уксусного ангидрида в безводном пиридине в количестве, указанном в табл.
25.1. Нагревают колбу на водяной бане в течение 1 ч, поддерживая уровень воды в бане на 2,5 см выше уровня жидкости в колбе. Вынимают колбу из бани и оставляют охлаждаться. Прибавляют 5 мл воды через верхний конец холодильника. При появлении мути прибавляют пиридин до образования прозрачного раствора, отмечая прибавленный объем. Колбу встряхивают и снова помещают в водяную баню на 10 мин. Вынимают колбу из бани и оставляют охлаждаться.    Обмывают холодильник и стенки колбы.
5 мл спирта 96 %, предварительно нейтрализованного по фенолфталеину. Содержимое колбы титруют 0,5 М раствором калия гидроксида спиртовым,
используя 0,2 мл 1 % раствора фенолфталеина в качестве индикатора. Проводят контрольный опыт в тех же условиях.

Таблица 1.

Навеска испытуемого вещества и объем ацилирующего агента

в зависимости от ожидаемого гидроксильного числа

Ожидаемое гидроксильное число

Навеска испытуемого вещества, г

Объем ацилирующего агента, мл

10–100

2,0

5,0

100–150

1,5

5,0

150–200

1,0

5,0

200–250

0,75

5,0

250–300

0,60 или 1,20

5,0 или 10,0

300–350

1,0

10,0

350–700

0,75

15,0

700–950

0,5

15,0

Гидроксильное число вычисляют по формуле:

IOH =

28,05 × (V2V1)

+ IA ,

a

где:    V1 – объем 0,5 М раствора калия гидроксида спиртового, израсходованный на титрование в основном опыте, в миллилитрах;

V2 – объем 0,5 М раствора калия гидроксида спиртового, израсходованный в контрольном опыте, в миллилитрах;

IA – кислотное число;

a – навеска испытуемого вещества, в граммах;

28,05 – количество миллиграммов калия гидроксида, содержащееся в 1 мл 0,5 М раствора калия гидроксида спиртового

 

Метод 2.

Точную навеску испытуемого вещества, указанную в частной фармакопейной статье, помещают в сухую коническую колбу вместимостью 5 мл с притертой пробкой и прибавляют 2,0 мл реактива пропионового ангидрида. Колбу закрывают, встряхивают до полного растворения испытуемого вещества и оставляют на 2 ч. Затем содержимое колбы переносят в коническую колбу вместимостью 500 мл, содержащую 25,0 мл 0,9 % раствора анилина в циклогексане и 30 мл уксусной кислоты ледяной. Содержимое колбы перемешивают круговым движением и оставляют на 5 мин. Прибавляют 0,05 мл 0,5 % раствора кристаллического фиолетового и титруют 0,1 М раствором хлорной кислоты до появления изумрудно-зеленой окраски. Проводят контрольный опыт в тех же условиях.

Гидроксильное число вычисляют по формуле:



IOH =

5,610 × (V2V1)

,

a

где:   V1 – объем 0,1 М раствора хлорной кислоты, израсходованный на титрование в основном опыте, в миллилитрах;

V2 – объем 0,1 М раствора хлорной кислоты, израсходованный в контрольном опыте, в миллилитрах;

a – навеска испытуемого вещества, в граммах;

5,610 – количество миллиграммов калия гидроксида, соответствующее 1 мл 0,1 М раствора хлорной кислоты.

Полученное значение гидроксильного числа пересчитывают с поправкой на содержание воды по формуле:

I'OH =   IOH − 31,1 × W,

где:    W – содержание воды в испытуемом веществе, в процентах.

Метод 3.

Точную навеску испытуемого вещества, указанную в табл. 25.2, помещают в коническую колбу вместимостью 250 мл с притертой пробкой и прибавляют 5 мл смеси свежеперегнанных пиридина и уксусного ангидрида (3:1). Присоединяют обратный холодильник и нагревают колбу на кипящей водяной бане в течение 1 ч, прибавляют 10 мл воды через холодильник и нагревают еще 10 мин. Охлаждают и прибавляют 25 мл бутанола, предварительно нейтрализованного по фенолфталеину 0,5 М раствором калия гидроксида спиртовым: сначала через холодильник прибавляют 15 мл, затем холодильник удаляют и обмывают стенки колбы 10 мл бутанола. Прибавляют 1 мл 1 % раствора фенолфталеина и титруют 0,5 М раствором калия гидроксида спиртовым. Проводят контрольный опыт в тех же условиях.

Определение свободных кислот. Около 10 г (точная навеска) испытуемого вещества помещают в коническую колбу вместимостью 125 мл, прибавляют 10 мл свежеперегнанного пиридина, предварительно нейтрализованного по фенолфталеину, прибавляют 1 мл 1 % раствора фенолфталеина и титруют 0,5 М раствором калия гидроксида спиртовым.

Гидроксильное число (IOH) вычисляют по формуле:

IOH = 28,05/a1 × [V1 + (a1 × V2/a2) − V],

где:    a1 и a2 – навески вещества в граммах, взятые для ацилирования и для определения свободных кислот, соответственно;

Vобъем 0,5 М раствора калия гидроксида спиртового, израсходованный на титрование в основном опыте после ацилирования, в миллилитрах;

V1 – объем 0,5 M раствора калия гидроксида спиртового, израсходованный на титрование в контрольном опыте при ацилировании, в миллилитрах;

V2 – объем 0,5 M раствора калия гидроксида спиртового, израсходованный при титровании свободных кислот, в миллилитрах;

28,05 – количество миллиграммов калия гидроксида, содержащееся в
1 мл 0,5 М раствора калия гидроксида спиртового.

Таблица 2

Навеска испытуемого вещества в зависимости

от ожидаемого гидроксильного числа

Ожидаемое

гидроксильное число

Навеска испытуемого вещества, г

Менее 20

10

20–50

5

50–100

3

100–150

2

150–200

1,5

200–250

1,25

250–300

1,0

300–350

0,75

 

При анализе окрашенных масел конечную точку титрования устанавливают потенциометрически.

2.3 Йодное число (ОФС 42-0121-09)

Йодным числом (II) называют количество граммов йода, связываемое 100 г испытуемого вещества. Йодное число характеризует содержание в испытуемом веществе непредельных соединений (например, непредельных жирных кислот в жирах или маслах).

Метод 1. Точную навеску испытуемого вещества в количестве, указанном в табл. 26.1, помещают в сухую колбу с притертой пробкой вместимостью 250 мл, растворяют в 3 мл эфира или хлороформа, прибавляют 20,0 мл 0,1 М раствора йода монохлорида, закрывают колбу пробкой, смоченной
10 % раствором калия йодида, осторожно встряхивают и выдерживают в темном месте в течение 1 ч.

Прибавляют последовательно 10 мл 10 % раствора калия йодида, 50 мл воды и титруют 0,1 М раствором натрия тиосульфата при постоянном энергичном встряхивании до светло-желтой окраски раствора. Прибавляют 3 мл хлороформа, сильно встряхивают, затем прибавляют 1 мл раствора крахмала и продолжают титрование до обесцвечивания раствора. Проводят контрольный опыт в тех же условиях.

При анализе твердых жиров навеску испытуемого вещества растворяют в 6 мл эфира, прибавляют 20 мл 0,1 М раствора йода монохлорида и 25 мл воды. Дальнейшее определение проводят, как указано выше.

Таблица 3.

Величина навески испытуемого вещества в зависимости

от ожидаемого йодного числа

Ожидаемое йодное число

   Навеска испытуемого вещества, г

Менее 30

1,1–0,7

31–50

0,7–0,5

51–100

0,5–0,25

101–150

0,25–0,15

Более 150

Менее 0,15

 

Йодное число вычисляют по формуле:

II =

1,269×(V2V1)

,

a

где:   V1   –   объем 0,1 М раствора натрия тиосульфата, израсходованный на титрование в основном опыте, в миллилитрах;

   V2   –   объем 0,1 М раствора натрия тиосульфата, израсходованный в контрольном опыте, в миллилитрах;

   a      навеска испытуемого вещества, в граммах.

Метод 2. Точную навеску испытуемого вещества в количестве, указанном в табл. 26.2, помещают в сухую колбу с притертой пробкой вместимостью 250 мл и растворяют в 15 мл хлороформа. Медленно прибавляют
25,0 мл раствора йода бромида. Колбу закрывают и выдерживают в темном месте в течение 30 мин, если не указано иначе в частной фармакопейной статье, часто встряхивая. Прибавляют последовательно 10 мл 10 % раствора калия йодида, 100 мл воды и титруют 0,1 М раствором натрия тиосульфата при постоянном энергичном встряхивании до светло-желтой окраски раствора. Прибавляют 5 мл раствора крахмала и продолжают титрование, прибавляя 0,1 М раствор натрия тиосульфата по каплям, до обесцвечивания раствора. Проводят контрольный опыт в тех же условиях.

Таблица 4.

Величина навески испытуемого вещества в зависимости

от ожидаемого йодного числа

Ожидаемое йодное число

Навеска испытуемого вещества, г

Менее 20

1,0

2060

0,50,25

60100

0,250,15

Более 100

0,150,10

Йодное число вычисляют по формуле, приведенной в методе 1.

2.4 Кислотное число (ОФС 42-0122-09)

Кислотным числом (IA) называют количество миллиграммов калия гидроксида, необходимое для нейтрализации свободных кислот, содержащихся в 1 г испытуемого вещества.

Метод. Точную навеску испытуемого вещества, в зависимости от ожидаемого кислотного числа (табл. 27.1), помещают в колбу вместимостью
250 мл и растворяют, если не указано иначе в частной фармакопейной статье, в 50 мл смеси равных объемов спирта 96 % и эфира, предварительно нейтрализованных 0,1 М раствором натрия гидроксида в присутствии 0,5 мл 1 % раствора фенолфталеина.

Таблица 5.

Ожидаемое кислотное число

Навеска испытуемого вещества, г

Менее 1

20

1–4

10

4–10

4

10–25

1,5

25–50

1

Более 50

0,5

 

При необходимости колбу нагревают с обратным холодильником на водяной бане до полного растворения испытуемого вещества. Прибавляют
1 мл 1 % раствора фенолфталеина и титруют 0,1 М раствором натрия гидроксида до появления бледно-розового окрашивания, не исчезающего в течение 30 с.

Кислотное число вычисляют по формуле:

IA =

V × 5,610

,

a

где:   V   –   объем 0,1 М раствора натрия гидроксида, израсходованный на титрование, в миллилитрах;

   a      навеска испытуемого вещества, в граммах;

   5,610   –   количество миллиграммов калия гидроксида, соответствующее 1 мл 0,1 М раствора натрия гидроксида.

3.Физико-химические методы анализа

3.1 Хроматография (ОФС 42-0092-09)

Хроматографией называется физико-химический метод разделения смесей, в котором разделяемые компоненты распределены между двумя фазами. одна из этих фаз (стационарная фаза) неподвижна, а другая (подвижная фаза) постоянно движется в определенном направлении.

по свойствам подвижной и неподвижной фаз хроматографические методы можно разделить на следующие типы, показанные на схеме (рис. 1.).

 

 

Рис. 1. Типы хроматографии

Результат хроматографического разделения представляется в виде хроматограммы.

Наиболее применима для эфирных масел газожидкостная хроматография.

 

3.1.1 Газожидкостная хроматография (ОФС 42-0095-09)

Газовая хроматография – это метод колоночной хроматографии, в котором подвижной фазой служит газ, движущийся через колонку, заполненную неподвижной фазой.

Применяют как газоадсорбционную, так и газожидкостную (преимущественно) хроматографию.

Анализ проводят на специальных приборах – газовых хроматографах.

Основные узлы газового хроматографа: источник подвижной фазы, устройство ввода пробы, колонка с термостатом, детектор, система сбора и обработки данных. Требуемые температурные режимы устройства ввода пробы, колонки и детектора устанавливаются в соответствующих термостатах.

Подвижная фаза

В качестве подвижной фазы используются азот, гелий или водород. Эти газы-носители могут подаваться в систему либо из баллонов, либо из газогенераторов, позволяющих получать газ высокой чистоты. Газ проходит через блок регулировки и стабилизации потока газа, обеспечивающий возможность измерения его скорости и давления на входе в хроматограф.

Ввод пробы.

Наиболее распространен способ ввода жидкой пробы (раствора) в испаритель шприцем через самоуплотняющуюся мембрану. Однако хроматограф может быть укомплектован дозатором (в том числе, автоматическим) для ввода газообразных, жидких или твердых веществ.

Инжектирование методом выдувания и накопления (purge and trap) используется для извлечения легколетучих компонентов и накопления их в специальной адсорбционной ловушке (колонке) с последующей быстрой тепловой десорбцией и вводом в хроматографическую колонку.

Устройство парофазного концентрирования (head-space) позволяет повысить чувствительность определения летучих соединений.

Колонки.

Используются три типа аналитических колонок: насадочные (набивные), микронасадочные и капиллярные.

Насадочные колонки (НК) изготавливаются из металла (нержавеющая сталь, никель, медь), стекла, тефлона и других материалов. Для разделения неустойчивых соединений (каталитически разлагающихся при контакте с металлической поверхностью) используют стеклянные или тефлоновые колонки. По форме НК бывают прямые, U-образные, W-образные и спиральные. Внутренний диаметр НК составляет от 2 до 4 мм, а длина – от 1 до 4–5 м. Внутренний диаметр микронасадочных колонок 0,5–1 мм и длина от 0,5 до
3 м.

Капиллярные колонки изготавливаются из кварца и имеют форму спирали. По своим характеристикам (внутреннему диаметру, d) они делятся на капиллярные (d = 0,2–0,3 мм, длина от 5 до 100 м), узкие капиллярные
(
d = 0,05–0,2 мм, длина от 5 до 100 м), капиллярные широкого диаметра
(
d = 0,3–0,8 мм, длина от 10 до 60 м) и поликапиллярные (d = 0,04 мм, длина 0,2 или 1 м).

В насадочных и микронасадочных колонках набивка сорбента внутри трубки должна быть плотной и однородной, без пустот. Чем плотнее и однороднее набивка, тем меньше размывание пиков и больше эффективность колонки.

В капиллярных колонках слой сорбента наносится на внутреннюю поверхность капилляра в виде слоя жидкой неподвижной фазы или в виде слоя адсорбента толщиной от 0,1 до 5,0 мкм, роль которого чаще всего выполняет полимерная пленка. В зависимости от характеристик капиллярных колонок и концентрации анализируемых соединений в образце введение пробы в колонку осуществляется с делением потока или без деления потока.

Системы программирования температуры колонки позволяют улучшить разрешение и сократить время анализа.

 

неподвижные фазы

В газоадсорбционной хроматографии в качестве сорбентов (адсорбентов) используют неорганические (силикагель – Сферосил, Порасил, Силихром и др.; графитированная термическая сажа – Карбопак С и В, Карбосив, Карбосфер; молекулярные сита – алюмосиликаты натрия и кальция) и пористые полимерные сорбенты.

В газожидкостной хроматографии неподвижная фаза (сорбент) представляет собой жидкость, нанесенную на твердый носитель. Носитель – относительно инертный адсорбент с низкой удельной поверхностью, на которой должна удерживаться неподвижная фаза в виде пленки равномерной толщины. Носитель должен быть механически прочным, иметь по возможности сферическую форму и макропористую структуру. Применяют минеральные и полимерные носители. Большинство минеральных носителей представляют собой переработанные диатомиты. Обычно используются носители с размерами частиц в интервалах от 125 до 150 мкм или от 150 до 180 мкм.

Неподвижные фазы – это обычно высококипящие жидкости. Они различаются по температурному пределу использования (низкотемпературные – до 100 °С; среднетемпературные – до 200 °С; высокотемпературные – до 350 °С) и по полярности. Все неподвижные фазы делят на 4 группы – неполярные, слабополярные, среднеполярные и сильнополярные.

По химическому составу неподвижные фазы в своем большинстве принадлежат к следующим классам: алифатические и ароматические углеводороды; фталаты и фосфаты; простые и сложные эфиры, полиэфиры; полигликоли; силоксаны с неполярными, среднеполярными и полярными радикалами; нитрилы и нитрилэфиры. Разработаны также привитые неподвижные фазы, которые представляют собой нанесенную химическим путем почти монослойную пленку. Такие сорбенты называются бондапаками. Они характеризуются высокой термостойкостью, большей инертностью и обеспечивают более высокую эффективность колонок по сравнению с другими сорбентами.

Методика

В описании методики должны быть указаны: тип колонки (насадочная или капиллярная), материал и размеры колонки, сорбент (тип твердого носителя и его характеристики, неподвижная жидкая фаза и ее количество), метод введения пробы и его параметры, температура испарителя, колонки и детектора, газ-носитель и его расход.

3.1.2Тонкослойная хроматография (ОФС 42-0094-09)

Хроматографический процесс в тонком слое сорбента, нанесенном на инертную твердую подложку (стеклянную, металлическую или полимерную), называется тонкослойной хроматографией или хроматографией в тонком слое сорбента (ТСХ).

В результате движения анализируемого вещества и элюента под действием капиллярных сил происходит разделение смеси исследуемых веществ на ее компоненты. При разделении вещества образуют на поверхности сорбента круглые или эллипсовидные пятна или полосы (хроматографические зоны).

Испытание на подлинность (идентификация) анализируемых веществ проводится при одновременном хроматографировании одинакового количества анализируемого вещества и стандартного образца на одной и той же хроматограмме. При этом если вещества идентичны, то соответствующие им хроматографические зоны имеют одинаковую форму, интенсивность поглощения или окраски и равные величины Rf.

При испытаниях на чистоту основное вещество и примеси в условиях хроматографирования должны иметь разные значения Rf. При этом можно судить о степени чистоты анализируемого вещества по величине и интенсивности пятен обнаруживаемых на хроматограмме примесей. Их содержание может быть определено полуколичественно. Для этого на пластинку наносят определенные количества анализируемого вещества и свидетелей. Для определения идентифицированных примесей в качестве свидетелей используют стандартные образцы идентифицированных примесей в количествах, соответствующих их предельному содержанию. Для определения неидентифицированных примесей чаще всего используют растворы сравнения, приготовленные путем разведения испытуемого раствора, как указано в частной фармакопейной статье. Содержание примеси в анализируемом веществе оценивают, сравнивая зону примеси по совокупности величины и интенсивности с соответствующими пятнами свидетеля.

Подвижные фаза (ПФ)

Подвижные фазы (элюенты) должны быть предпочтительно малотоксичными, содержать минимум компонентов, не вступать в химические реакции ни с сорбентом (НФ, неподвижной фазой), ни с компонентами разделяемой смеси. ПФ должны также достаточно быстро испаряться с поверхности хроматограмм после элюирования.

 

 

3.1.3 Высокоэффективная жидкостная хроматография (ОФС 42-0096-09)

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) – это метод колоночной хроматографии, в котором подвижной фазой (ПФ) служит жидкость, движущаяся через хроматографическую колонку, заполненную неподвижной фазой (сорбентом). Колонки для ВЭЖХ характеризуются высоким гидравлическим давлением на входе в колонку, поэтому ВЭЖХ иногда называют «жидкостной хроматографией высокого давления».

В зависимости от механизма разделения веществ различают следующие варианты ВЭЖХ: адсорбционную, распределительную, ионообменную, эксклюзионную, хиральную и др.

В адсорбционной хроматографии разделение веществ происходит за счет их различной способности адсорбироваться и десорбироваться с поверхности адсорбента с развитой поверхностью, например, силикагеля.

В распределительной ВЭЖХ разделение происходит за счет различия коэффициентов распределения разделяемых веществ между неподвижной (как правило, химически привитой к поверхности неподвижного носителя) и подвижной фазами.

Нормально-фазовым называют вариант хроматографии, в котором используются полярный сорбент (например, силикагель или силикагель с привитыми NH2- или CN-группами) и неполярная ПФ (например, гексан с различными добавками). В обращенно-фазовом варианте хроматографии используют неполярные химически модифицированные сорбенты (например, неполярный алкильный радикал C18) и полярные подвижные фазы (например, метанол, ацетонитрил).

В ионообменной хроматографии молекулы веществ смеси, диссоциировавшие в растворе на катионы и анионы, разделяются при движении через сорбент (катионит или анионит) за счет их разной скорости обмена с ионными группами сорбента.

Метод ВЭЖХ может применяться для контроля качества любых негазообразных анализируемых веществ. Для проведения анализа используют соответствующие приборы – жидкостные хроматографы.

Неподвижная фаза (сорбент)

В качестве сорбентов обычно применяются:

1. Силикагель, оксид алюминия, пористый графит используются в нормально-фазовой хроматографии. Механизм удерживания в данном случае – обычно адсорбция;

2. Смолы или полимеры с кислотными или основными группами. Область применения – ионообменная хроматография;

3. Пористый силикагель или полимеры (эксклюзионная хроматография);

4. Химически модифицированные сорбенты (сорбенты с привитыми фазами), приготовленные чаще всего на основе силикагеля. Механизм удерживания в большинстве случаев – распределение между подвижной и неподвижной фазами;

5. Химически модифицированные хиральные сорбенты, например производные целлюлозы и амилозы, протеины и пептиды, циклодекстрины, используемые для разделения энантиомеров (хиральная хроматография).

Подвижная фаза(ПФ)

В качестве ПФ могут применяться разнообразные растворители – как индивидуальные, так и их смеси.

В нормально-фазовой хроматографии обычно применяются жидкие углеводороды (гексан, циклогексан, гептан) и другие относительно неполярные растворители с небольшими добавками полярных органических соединений, которые регулируют элюирующую силу ПФ.

В обращено-фазовой хроматографии в состав ПФ входят полярные органические растворители (обычно ацетонитрил и метанол) и вода. Для оптимизации разделения часто используют водные растворы с определенным значением рН, в частности буферные растворы. Применяют добавки неорганических и органических кислот, оснований и солей и другие соединения (например, хиральные модификаторы для разделения энантиомеров на ахиральном сорбенте).

Ионообменная и ионная хроматография

Ионообменная хроматография используется для анализа как органических (гетероциклические основания, аминокислоты, белки и др.), так и неорганических (различные катионы и анионы) соединений. Разделение компонентов анализируемой смеси в ионообменной хроматографии основано на обратимом взаимодействии ионов анализируемых веществ с ионными группами сорбента. В качестве сорбентов используются аниониты или катиониты. Эти сорбенты представляют собой, в основном, либо полимерные ионообменные смолы (обычно сополимеры стирола и дивинилбензола с привитыми ионными группами), либо силикагели с привитыми ионообменными группами. Сорбенты с группами —(СН2)3N+Х используются для разделения анионов, а сорбенты с группами —(СН2)SО3Н+ – для разделения катионов. Обычно для разделения анионов применяют полимерные смолы, а для разделения катионов – модифицированные силикагели.

В качестве ПФ в ионообменной хроматографии применяют водные растворы кислот, оснований и солей. Обычно используются буферные растворы, позволяющие поддерживать определенные значения рН. Возможно также использование небольших добавок смешивающихся с водой органических растворителей – ацетонитрила, метанола, этанола, тетрагидрофурана.

Ионная хроматография — вариант ионообменной хроматографии, в котором для определения концентрации ионов анализируемого вещества используется кондуктометрический детектор. Для высокочувствительного определения изменений электропроводности проходящей через детектор ПФ фоновая электропроводность ПФ должна быть низкой.

Существуют два основных варианта ионной хроматографии.

Первый из них основан на подавлении электропроводности электролита ПФ с помощью второй ионообменной колонки, находящейся между аналитической колонкой и детектором. В этой колонке происходит нейтрализация ПФ и анализируемые соединения попадают в ячейку детектора в деионизированной воде. Детектируемые ионы являются единственными ионами, обеспечивающими проводимость ПФ. Недостаток подавляющей колонки – необходимость ее регенерации через достаточно короткие промежутки времени. Подавляющая колонка может быть заменена непрерывно действующим мембранным подавителем, в котором состав мембраны непрерывно обновляется потоком регенерирующего раствора, движущегося в направлении, противоположном направлению потока ПФ.

Второй вариант ионной хроматографии – одноколоночная ионная хроматография. В этом варианте используется ПФ с очень низкой электропроводностью. В качестве электролитов широко применяют слабые органические кислоты – бензойную, салициловую или изофталевую.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Заключение

Все приведенные выше методы анализа основаны на зависимости физ. свойств вещества от его природы, причем аналитический сигнал представляет собой величину физического свойства, функционально связанную с концентрацией или массой определяемого компонента. Физико-химические методы анализа могут включать химические превращения определяемого растворение образца, концентрирование анализируемого компонента, маскирование мешающих веществ и др. В отличие от "классических" химических методов анализа, где аналитическим сигналом служит масса вещества или его объем, в физико-химических методах анализа в качестве аналитического сигнала используют интенсивность излучения, силу тока, электропроводность, разность потенциалов и др   .

К важным физико-химическим методам анализа принадлежит хроматография ( газовая хроматография, жидкостная хроматография, ионообменная хроматография, тонкослойная хроматография). Успешно развиваются методы, основанные на измерении скоростей химических реакций (кинетические методы анализа.

При выполнении физико-химических методов анализа используют специальную, иногда довольно сложную, измерительную аппаратуру, в связи с чем эти методы часто называются инструментальными. Многие современные приборы оснащены встроенными ЭВМ, которые позволяют находить оптимальные условия анализа.

 

 

 

 

 

 

 

Список литературы

1. Государственная Фармакопея РФ XII изд. В 2-х выпусках – М.: Медицина, 2007. – Выпуск 1684 с.

2. Химический анализ лекарственных растений / Под ред. Н.И. Гринкевич, Л.Н. Сафронич. – М.: Высшая школа, 1983. – 176 с.

3. Сидоров И.И., Турышева Н. А., Фалеева Л.П., Ясюкевич Е.И. Технология натуральных эфирных масел и синтетических душистых веществ М.; Легкая и пищевая промышленность,1984. 368 с.

4. Машковский М.Д. Лекарственные средства: В 2 т. – 14-е изд. перераб. и доп. / М.Д. Машковский – М.: Новая волна, 2000. – 2 т.

5.